很(hěn)多(duō)小(xiǎo)夥伴在養細胞的(de)時(s×‍•Ωhí)候，總是(shì)會(huì)出現(xià×™>"n)這(zhè)樣或那(nà)樣的(de)問(wèn♦€)題，很(hěn)多(duō)時(shí)候，那(nà)是(s​‍hì)因為(wèi)你(nǐ)沒有(yǒu)注意以下(xià)的(de★α≤§)細節問(wèn)題，現(xiàn)在我們一(yī¥​ ‍)起來(lái)看(kàn)看(kàn)：

細胞培養前的(de)準備

在您帶上(shàng)手套開(kāi)始細胞培養之前,↔♥先檢查一(yī)下(xià)移液管和(hé)瓶子(zǐ)的(de)☆φ數(shù)量是(shì)否充足,以免在開(kāi)始實驗後再次出入操作(zuò)台↔•☆★，這(zhè)樣可(kě)以降低(dī)細胞污染的(de)風(fēng)險。

細胞培養基也(yě)應先預熱(rè),選擇隻預熱(rè)部λ✔©分(fēn)培養基而非整瓶加熱(rè),不(bù)<δε<但(dàn)可(kě)以節約實驗時(shí)間(jiān),而且可(kě)以避免€•✔因反複加熱(rè)培養基而造成的(de)蛋白(bái)質降解。

結束操作(zuò)後,别忘了(le)培養基對(duì)光(guāng)敏感φ☆↔,應盡可(kě)能(néng)避光(guāng)保存。

細胞培養的(de)定期檢查

定期檢查培養細胞的(de)形态，即形狀和(α☆<hé)外(wài)觀，對(duì)于細胞培 ‍β養實驗取得(de)成功至關重要(yào)÷₽₹。

除确認細胞的(de)健康狀态外(wài)，每次操作(zuò)細胞時(★ shí)通(tōng)過肉眼和(hé)顯微(wēi)鏡檢查細胞還÷≈∏(hái)可(kě)早期發現(xiàn)污染征象，避免污染擴散至實驗室其他(tā)細胞。

細胞變質的(de)征象

細胞變質的(de)征象包括核周出現(xiàn)顆粒、細胞與基質解離(lí)">↔以及細胞質空(kōng)泡形成。

這(zhè)些(xiē)變質征象可(kěδ≈Ω&)能(néng)為(wèi)多(duō)種原因所緻，例如(rú)：

培養物(wù)污染、細胞系衰老(lǎo)或培養基中存在毒性物(wù₽γ$∞)質，或者這(zhè)些(xiē)征象僅表明(míng)培養物( ™£wù)需要(yào)更換培養基。

變質嚴重時(shí)将會(huì)成為(wèi)不(bù)可(kě)逆的(de)變化¥≤(huà)。

細胞培養通(tōng)風(fēng)櫥的(de)消毒<§γ及布局

1、保持細胞培養通(tōng)風(fēng)櫥內(n¥₩±∏èi)的(de)整潔有(yǒu)序，将所有(yǒu)物(wù)品置于直視(s→> εhì)範圍內(nèi)。

2、向放(fàng)入通(tōng)風(fēn•>∏∞g)櫥內(nèi)的(de)所有(yǒu)物(wù)品噴灑70↕¶%乙醇，擦拭清潔進行(xíng)消毒。

3、在通(tōng)風(fēng)櫥中部開$✘‌≤(kāi)闊處放(fàng)置細胞培養容器(qì)；移液器(qì)置于右前方易于取用(yòng)；α♥ 試劑和(hé)培養基置于右後方便于吸取；試¶♥ε∏管架置于中後部；小(xiǎo)型容器(qì)置于σ∞₽δ左後部用(yòng)于盛放(fàng)廢液。

培養瓶/皿等物(wù)品的(de)無菌操作(zu$±ò)

無菌培養瓶、試劑瓶、培養皿等物(wù)品使用(yòng)時(≤≥×shí)方可(kě)揭開(kāi)蓋子(zǐ)，不(bù)得​γ↔®(de)将其開(kāi)放(fàng)暴露于'→☆環境中，操作(zuò)完成後盡快(kuài)蓋上(shàng)蓋子(zǐ)，取下✔←(xià)蓋子(zǐ)時(shí)應将蓋子(zǐ)開(kāi)口朝下(xià)放(fà'♠€£ng)在工(gōng)作(zuò)台面上(shàng)。

進行(xíng)無菌操作(zuò)時(shí)不(bù)要(yào)說(shuō)話(huà)γ‍ ≥、唱(chàng)歌(gē)或吹口哨。盡快(kuài)完成實驗，以盡量避免污染。

細胞培養中可(kě)能(néng)的(de)污染物(wù)

細胞培養污染物(wù)主要(yào)分(fēn)為(wèi)≤≤σ 兩類：

1、化(huà)學污染物(wù),如(rú)培養基、血清和(hé)水(shuǐ)中的(de↑δ☆)雜(zá)質、內(nèi)毒素、增塑劑和(hé)去(qù÷×)污劑。

2、生(shēng)物(wù)污染物(wù)，如(rú)細菌、黴σ≥≥∑菌、酵母、病毒、支原體(tǐ)以及其他(tā)細胞系ασ的(de)交叉污染。

可(kě)通(tōng)過充分(fēn)了(le)解污染源以及采用(yòng)良好(hǎo)的(d★≥↓e)無菌技(jì)術(shù)，降低(dī)污染發生(shēng)的(de)頻(pí ¶n)率和(hé)嚴重程度。

交叉污染的(de)确認

交叉污染雖不(bù)如(rú)微(wēi)生(shēng)物(♥∑wù)污染普遍，但(dàn)與HELA細胞及其他(tā)生×$λ(shēng)長(cháng)迅速的(de)細胞系間(jiān)廣÷ε泛的(de)交叉污染是(shì)個(gè)明(míng)确的(de)問(wèn)題ππ，會(huì)造成嚴重後果。

從(cóng)聲譽好(hǎo)的(de)細胞庫獲取細胞系、™₩•定期檢查細胞系性質及采用(yòng)良好(hǎo)的(de)無菌技(jì)術(shù)有(β yǒu)助于避免交叉污染。

通(tōng)過DNA指紋圖譜、核型分(fēn)析和(hé)同位素分(fē ‌®£n)析可(kě)确認有(yǒu)無交叉污染。

細胞換液注意事(shì)項

為(wèi)細胞換液時(shí)，要(yào)沿著(zhe)培養瓶的(de ↑↑₹)一(yī)側輕輕地(dì)加入，而不(bα☆§σù)是(shì)直接加到(dào)細胞中，以免損傷細胞，當培養的(d×™φ e)細胞株較為(wèi)脆弱時(shí)尤其需要(yào)注意。

使用(yòng)無菌玻璃吸管或一(yī)次性塑料吸管和(hé)移液器(qì)操作(zuò)液體(t™×ǐ)時(shí)，每支吸管隻能(néng)使用(yòng)一(yī)次，以•β★免交叉污染。

細胞傳代的(de)時(shí)間(jiā₽​→n)把握

當細胞呈指數(shù)增殖，貼壁培養的(de)細胞已占據所有(yǒu)可(kě)用(yòn↕σγ£g)基質、沒有(yǒu)擴增空(kōng)間(jiān)， ∏或懸浮培養的(de)細胞已超過培養基質所支撐的(de)能(nén↔₽®×g)力，無法進一(yī)步生(shēng)長(cháng)時(shí)，細胞增殖速度将大(÷÷×dà)大(dà)降低(dī)甚至完全停止。

為(wèi)了(le)将細胞密度維持在最佳水(shuǐ)平，以便細胞繼續生(s×↓hēng)長(cháng)，并且刺激進一(yīα∞β)步增殖，必須對(duì)細胞進行(xíng)傳代。

細胞培養中使用(yòng)抗生(shēng)素的(de)注意事(shì)項

細胞培養時(shí)不(bù)應長(cháng)期使用(yòng)抗生(shēn​¶±g)素，因為(wèi)連續使用(yòng)抗生(sλ♥​hēng)素會(huì)促進抗生(shē₩"≈™ng)素耐藥性細胞株的(de)産生(shēng)，導緻輕度污染持續存在。♥λ§

抗生(shēng)素隻能(néng)作(zuò)為(wèi)對(duì)付污染的(de ₩)最後手段短(duǎn)期使用(yòng)，并盡快(kuài ↔)撤除。

如(rú)果長(cháng)期使用(yòng)抗生(shēng)素，則應同時(Ω★♥πshí)進行(xíng)無抗生(shēng)素培養，以便作(zuò)為(wèi)鑒别隐性感₽ 染的(de)對(duì)照(zhào)。

細胞凍存的(de)必要(yào)性

連續培養的(de)細胞系容易發生(shēng)遺傳漂變，有(yǒu↑¥)限細胞系最終會(huì)發生(shēng↑≤§)衰老(lǎo)，所有(yǒu)培養的(dεβ✘‌e)細胞都(dōu)易受到(dào)微(w'®₹™ēi)生(shēng)物(wù)污染，即使運轉情況最好(hǎo)的(de¶©≠)實驗室也(yě)會(huì)遇到(dào)‍‍'δ設備故障的(de)問(wèn)題。

由于已建立的(de)細胞系是(shì)一(yī)種寶貴資源，更換細胞>∏系成本高(gāo)昂，而且耗費(fèi)時≠∏(shí)間(jiān)，因此，必須将其冷(lě∏®ng)凍起來(lái)，長(cháng)期保'≈存。

細胞凍存的(de)事(shì)項

應在細胞濃度高(gāo)的(de)情況下(xià)進行(xí÷∞ng)細胞培養凍存，并且細胞傳代的(de)次數(shù)盡可(kě)能(néng)少(shǎo≠ ∑)。

在凍存前确保活細胞的(de)百分(fēn)比至少(shǎo)為(wèi)90%。

請(qǐng)注意，最佳凍存條件(jiàn)取決于所♥♦φ 用(yòng)細胞系。

凍存和(hé)複蘇過程對(duì)大(dà)多(duō↕δ→)數(shù)細胞都(dōu)會(huì)造成不(bù)利影(yǐng)響，因此不(b <>&ù)要(yào)通(tōng)過渦旋震蕩或者用(yòng) ÷力敲打培養瓶的(de)方法使細胞脫落（培養昆蟲細胞時(shí)除外(wài)），也(→÷♠₽yě)不(bù)要(yào)高(gāo)速離(lí)心細胞。

凍存培養基的(de)選擇

凍存細胞時(shí)必須選擇凍存培養基，凍存培養基中應含有(yǒu)DMSO或者甘油等冷♥↑☆±(lěng)凍保護劑。

還(hái)可(kě)使用(yòng)專門(m♠≤én)配制(zhì)的(de)完全凍存培養基，例如(rφ←≈ú)HyClone、Gibco的(de)細胞凍存培養基。

細胞培養溫度的(de)設定

細胞培養的(de)最佳溫度主要(yào)取決于細胞供體(tǐ)的(de)體(tǐ± ​)溫，此外(wài)也(yě)受到(dào)解刨部位體(tǐ)溫差異的ε® £(de)影(yǐng)響，例如(rú)：皮膚溫度低(dī)于骨¶Ω骼肌的(de)溫度。

與溫度過低(dī)相(xiàng)比，細胞培養時(shí)溫度過高(gāo)時(shí)更為↓¶(wèi)嚴重的(de)問(wèn)題：因₩☆δ£此，往往将培養箱的(de)溫度設定為(wèi)略低(dī)于最佳溫度®☆™™。

各類細胞培養的(de)最佳溫度

大(dà)多(duō)數(shù)人(rén)和(hé)哺乳動物(wù)細胞系在3↔∑≠×6℃~37℃下(xià)具有(yǒu)最佳生(shēng)長(cháng)狀态。

昆蟲細胞在27℃具有(yǒu)最佳生(shēng₹δ)長(cháng)狀态；在低(dī)于27℃以及27至30℃範圍內(nèi)，細胞生(shē£₹♦ng)長(cháng)較慢(màn)。

溫度超過30℃時(shí)，昆蟲細胞活力降低(dī)，即使溫度降至27℃，≤≤✔ 細胞活力也(yě)無法恢複。

禽類細胞系在38.5℃時(shí)具有(yǒu)最佳生(shēng)<π↓ 長(cháng)狀态。雖然此類細胞也(yě)可∏♠(kě)在37℃下(xià)培養，但(dàn)其生(shēng)↕$長(cháng)速度會(huì)變慢(màn)。

來(lái)源于冷(lěng)血動物(wù)（例如(★≠rú)：兩栖動物(wù)、冷(lěng)✘γ水(shuǐ)魚）的(de)細胞系可(kě)耐™♥∞受很(hěn)寬的(de)溫度範圍，為(wèi)15-2ΩΩ6℃。

請(qǐng)注意每種細胞的(de)培養條件(j∏₽iàn)均有(yǒu)所不(bù)同，偏離(™‍≤lí)某種細胞所需的(de)培養條件(jiàn)會(hu♠‌‌→ì)導緻細胞表型異常，甚至培養完全失敗。

因此，我們建議(yì)您應熟悉自(zì)己使用(yòng)的(de)細胞系，實→₹驗中嚴格遵守所有(yǒu)産品附帶的(de)操作(∏•★zuò)說(shuō)明(míng)。

細胞培養的(de)最适pH

大(dà)多(duō)數(shù)正常的(de)哺乳♣€©動物(wù)細胞系都(dōu)能(néng)在pH值為(wèi)7.4的≥ ♣(de)環境中生(shēng)長(cháng)良好(hǎo)，而且不(bù)同細胞株間₩£(jiān)差異極小(xiǎo)。

但(dàn)是(shì)，目前發現(xiàn)有(yǒu)些(xiē)轉化(h>•‍uà)細胞系在輕度偏酸性的(de)環境中即pH7.0-7.4時(shí)生(shēng)≈↓&長(cháng)較好(hǎo)，而有(yǒu)些(xi¥σ≈ē)正常的(de)成纖維細胞系更适合輕度偏堿性的(de)環境即pΩ♥★H為(wèi)7.4-7.7。

Sf9和(hé)Sf21等昆蟲細胞系最适合在pH值為(wèi)6.2的(←₹δεde)環境中生(shēng)長(cháng)。

細胞培養基最适pH的(de)控制(zhì)

細胞培養基可(kě)控制(zhì)培養體(tǐ)系的(de)pH值，為(wèi)培養的(d <e)細胞緩沖pH值的(de)變化(huà)。

這(zhè)種緩沖作(zuò)用(yòng)通(tōng)常是(shì)通(tō™β♠αng)過添加有(yǒu)機(jī)緩沖鹽（例如(rú)：HEPES）或者二氧化(huà)碳-‌€碳酸氫鹽緩沖鹽實現(xiàn)。

由于培養基的(de)pH值取決于溶解态二氧化βγ(huà)碳與碳酸氫鹽間(jiān)的(de)精密平衡，因此空(kōng€±)氣中二氧化(huà)碳含量的(de)變化(huà)會(huì)改'↓變培養基的(de)pH值。

為(wèi)此，使用(yòng)二氧化(huà)碳-碳酸氫鹽緩沖鹽培養基時(shí)必須"♣₽使用(yòng)外(wài)源性二氧化(huà)碳，特别是(shì)使用(yòng)開(<×✘™kāi)放(fàng)式培養皿培養細胞或者進行(xíng)高(gāo)λ★濃度的(de)轉化(huà)細胞系培養時(shí)。

細胞培養中血清的(de)保存

細胞培養中所用(yòng)的(de)血清不(bù)盡相(xiàng)同，您需要(→γyào)根據您所培養的(de)細胞種類和(hé)培養要(y"↑≥ào)求來(lái)挑選出最适合的(de)血清。

我們建議(yì)将血清保存在-10至-20℃，若存放(fàng)于4℃，請(qǐng∑×→€)勿超過一(yī)個(gè)月(yuè)。

若您無法一(yī)次用(yòng)完一(yī)瓶，建議(yì)您将血清無菌分(fēn)裝至合适↑☆↑體(tǐ)積的(de)滅菌容器(qì)內(nèi)，再放(fàng)回σ↑‍冷(lěng)凍箱保存。

解凍血清時(shí)，建議(yì)您将血清從(cóng≠₽)冷(lěng)凍箱取出後，先置于2-8℃冰箱過€σ>夜融解，然後在室溫下(xià)使之全融。需要(yào)注意的(de)是(shì)，♣&$融解過程中必須規則地(dì)搖晃均勻。

如(rú)何在細胞鋪闆時(shí)避免“邊緣效應”

細胞實驗鋪闆時(shí)，為(wèi)避免“邊緣效✔×應”，以應用(yòng)96孔闆的(de)中間(jiān)60孔為(w←Ωèi)最佳，一(yī)般四周的(de)一(yī)圈邊緣孔不(bù)養®>δ細胞，隻做(zuò)空(kōng)白(bái)或陰性↔‌÷₩對(duì)照(zhào)。

鋪闆時(shí)，細胞懸液一(yī)定要(y→§ào)混勻，以避免細胞沉澱下(xià)來(lá‌♥±÷i)而導緻每孔中的(de)細胞數(shù)量不(bù)等，可(kě)以每接幾個γ​ (gè)就(jiù)再混勻一(yī)下(xià)。

加樣器(qì)操作(zuò)要(yào)熟練，盡量避免人(rén)為(wèi)誤差。©"↔→此外(wài)，吹散次數(shù)過多(duō)也(yě)會(huì)影(yǐng)響細胞活力。€‍"所以要(yào)熟練操作(zuò)，盡快(kuài)上(shàng)闆。

何時(shí)選擇使用(yòng)熱(rè)滅活血清

加熱(rè)血清可(kě)以滅活補體(tǐ)系統。

啓動的(de)補體(tǐ)參與溶解細胞事(shì)件(jiàn)，刺激平滑肌收★↑§縮，細胞和(hé)血小(xiǎo)闆釋放(fàng)組胺，啓動淋巴細胞和(hé)巨噬細胞活γ¥β化(huà)。

在免疫學研究、培養ES細胞、昆蟲細胞和(hé)平滑肌細胞時(shí)，推薦使&♦≈用(yòng)熱(rè)滅活血清。

熱(rè)滅活血清可(kě)能(néng)出現(xiàn)的(de)¥☆×₹現(xiàn)象

在免疫學研究、培養ES細胞、昆蟲細胞和(hé)平滑肌細胞時(shí)，推薦₹©π使用(yòng)熱(rè)滅活血清。

而對(duì)于其他(tā)大(dà)多(duō)數(shù)的(de)細胞來(l•←πái)說(shuō)是(shì)不(bù)需®®£♠要(yào)熱(rè)滅活血清的(de)£•>。

熱(rè)滅活血清對(duì)細胞的(de)生(shēng)長(cháng)隻有(yǒu)微(σ♥∑wēi)小(xiǎo)的(de)促進，或完全沒有(yǒu)任何作(zuò)用(yòng)★ ¶，甚至可(kě)能(néng)因為(wèi)高(gāo)溫處理(lǐ)影(α÷yǐng)響了(le)血清的(de)質量，而造成細胞生(shēng)長(≤♦₽×cháng)速率的(de)降低(dī)；經過熱(rè)處理(lǐ)的(de)血清，沉澱物(✘σwù)會(huì)顯著地(dì)增多(duō)，這→₩☆(zhè)些(xiē)沉澱物(wù)在倒置顯微(wēi)鏡下(xià)觀察，像是(shì)“小(¶∞xiǎo)黑(hēi)點”，常常會(huì)讓研究者誤以∞♦φ為(wèi)是(shì)血清遭受污染，而把血清放γα←(fàng)在37度環境中，又(yòu)會(huì)使此沉澱物(wù)增多(duō)，使研究者'₽誤認為(wèi)是(shì)微(wēi)生(shēng)物(wù)的(de)分(fēn)裂擴增'♣₹。

您可(kě)以根據您的(de)研究需要(yào)選擇是(shì)否需要(yβ↓&ào)熱(rè)滅活血清。

如(rú)此一(yī)來(lái)，不(bù)但(>♦dàn)能(néng)确保血清的(de)質量，而且能(₽≈néng)夠節省您寶貴的(de)時(shí)間(jiān)。

如(rú)何正确熱(rè)滅活血清

熱(rè)滅活時(shí)請(qǐng)将血清置于56℃水(shuǐ)浴30分(fēn)鐘(zhō↕σεαng)。

為(wèi)盡量減少(shǎo)熱(rè)滅活對(duì)血清品質的(deα™♣β)影(yǐng)響，一(yī)次滅活的(de)血清體(tǐ)積不(bù)宜過大(dà)。

最好(hǎo)準備同樣的(de)容器(qì)裝相(xiàng)等體(tǐ)積的(de)水(→₹♣☆shuǐ)（與血清相(xiàng)同溫度），滅活時(shí)将裝有(yǒu)血清和(♥"♣±hé)水(shuǐ)的(de)容器(qì)同時(shí)放(fàng)入56℃水(£ε↕∏shuǐ)浴，在裝水(shuǐ)的(de)容器(qì)中放(fàng)置溫度計(jì)，加熱(rè₽§‍∞)過程中不(bù)時(shí)地(dì)輕輕旋轉混勻血清，當溫度計(jì)顯示達到(dào)56℃ ®↕‌左右，開(kāi)始計(jì)時(shí)。