實驗原理(lǐ)：Cell Counting Kit-8（簡​βε✘稱CCK-8）試劑可(kě)用(yòng)于簡便而準确的(de)細胞增殖和(™≈ hé)毒性分(fēn)析。其基本原理(lǐ)為(wèi)：該試Ω☆劑中含有(yǒu)WST-8【化(huà☆✔‍)學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3∑₽‍-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑¶®單鈉鹽】，它在電(diàn)子(zǐ)載體(tǐ)1-甲氧基-5-甲基吩嗪↕★鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的(de)作(zu ‍♠ò)用(yòng)下(xià)被細胞中的(de)脫氫酶還(hái★σ ​)原為(wèi)具有(yǒu)高(gāo)度ε≤♦水(shuǐ)溶性的(de)黃(huáng)色甲瓒産物(w✘↕×​ù)（Formazan dye）。生(shēng)成的(de)甲瓒物(wù)的(de)數(shφ±ù)量與活細胞的(de)數(shù)量成正比。因此可(kě)利用(y×₩∞​òng)這(zhè)一(yī)特性直接進行(xíng)細胞增殖和(hé)★≈β毒性分(fēn)析。

一(yī)、用(yòng)途：

  藥物(wù)篩選、

  細胞增殖測定、

  細胞毒性測定、

  腫瘤藥敏試驗等。

二、優點：

· 使用(yòng)方便，省去(qù)了(le)洗滌細胞，☆≈↔不(bù)需要(yào)放(fàng)射性同位素∏¥♦÷和(hé)有(yǒu)機(jī)溶劑；

· CCK-8法能(néng)快(kuài)速檢測；

· CCK-8法的(de)檢測靈敏度很(hě≈☆'n)高(gāo)，甚至可(kě)以測定較低(dī)細胞密度；

· CCK-8法的(de)重複性優于MTT 法，MTT 實驗生(♦≥★Ωshēng)成的(de)formazan←≠ 不(bù)是(shì)水(shuǐ)溶性的(de)，需要(y'&γào)使用(yòng)DMSO 等有(yǒu)機(jī)溶劑溶解； 而本方法産生(sh≈♦<ēng)的(de)formazan 是(shì)水(sh♥★∞uǐ)溶性的(de)，不(bù)僅省去(qù)了(le)溶解步驟，更因此而減少(shǎo)了(le>↑‍<)該操作(zuò)步驟帶來(lái)的(de)誤差；

· CCK-8法對(duì)細胞毒性小(σ≈$σxiǎo)，可(kě)以多(duō)次測↓✘•定選取最佳測定時(shí)間(jiān)，與₩₹'αMTT 方法相(xiàng)比線性範圍更寬，靈敏度更高(♦♠>•gāo)；

· CCK-8細胞活性檢測試劑中為(wèi)1瓶溶液，毋需預制(zhì)，即開(k♥★āi)即用(yòng)。

三、所需設備及儀器(qì)：

1. 10ul，100-200ul及多(duō)通(tōng)道(dào)移÷π液器(qì)

2. 酶标儀（帶有(yǒu)450nm濾光(gu ≠āng)片）

3. 96孔培養闆

4. 二氧化(huà)碳培養箱

四、方法及步驟：

實驗一(yī)：細胞增殖分(fēn)析

1、制(zhì)備細胞懸液：細胞計(jì)數(shù)。

2、接種到(dào)96孔闆中：根據合适的(de)鋪闆細胞數(shù)（約1-2×104），§→γ¥每孔約100ul細胞懸液，同樣的(de)樣本可(kě)做(z<↓♥uò)4-6個(gè)重複。

3、37℃培養箱中培養：細胞接種後貼壁大(dà)約需要(yào)培養4小(xiǎo)時(shí)， φ®←如(rú)果不(bù)需要(yào)貼壁，這(zhè)步可(kě)以省去(qù)Ω↑。

4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少(shǎo)，有(yǒu)可(k✘≠ě)能(néng)因試劑沾在孔壁上(shàng)而帶來(lái)誤差，建議(yì)将槍頭≈∏浸入培養液中加入且在加完試劑後輕輕敲擊培養闆以幫助混勻。或者直接配置含10%CC₹σ¶φK8的(de)培養基（現(xiàn)用(yòng)現(x↑‍iàn)配），以換液的(de)形式加入。

5、培養0.5-4小(xiǎo)時(shí):細胞種類不(bù)同←₽，形成的(de)Formazan的(de)量也(yě​φ₹)不(bù)一(yī)樣。如(rú)果顯色不(bù)夠的(de)話(huà)，可(k§∑ εě)以繼續培養，以确認最佳條件(jiàn)（建議(yì)預ΩΩ≥實驗先摸清楚時(shí)間(jiān)點）。"‌♣特别是(shì)血液細胞形成的(de)Formazan很(hěn)少(shǎ"♦σ‌o)，需要(yào)較長(cháng)的(✔ & de)顯色時(shí)間(jiān)（5-6小(xiǎo)時(shí)）。

6、測定450nm吸光(guāng)度：建議(yì)采用(yòng)雙波長(ch∞₽áng)進行(xíng)測定，檢測波長(chá♦↓π∏ng)450-490nm，參比波長(cháng)600-650★×εnm。

實驗二：細胞毒性分(fēn)析

1、制(zhì)備細胞懸液：細胞計(jì)數(shù)

2、接種到(dào)96孔闆中：根據合适的(d×←e)鋪闆細胞數(shù)（約≥5×104），每孔約100ul細胞懸液Ω∞，同樣的(de)樣本可(kě)做(zuò)4-6個(gè)重複。

3、37℃培養箱中培養：細胞接種後貼壁大(dà)約需要(yào)培養4小(xα<iǎo)時(shí)，如(rú)果不(bù)需要(yào)貼壁，這(zhè)步可(k∞¶ě)以省去(qù)。

4、加入不(bù)同濃度的(de)毒性物(wù)質。

5、37℃培養箱中培養：加入毒性物(wù)質的(de)培養時(shí)間(ji ‌$ān)，要(yào)看(kàn)毒性物(wù)質的(de)性質和(hé)細胞的(de)↓≠★敏感性，一(yī)般要(yào)根據細胞周期來(lái)決定，起碼要(yào)一(yī)代 ♣以上(shàng)的(de)時(shí)間(jiān)（★₹©∞例如(rú)：6、12、24、48、60、72小(xiǎo)∏₩₹時(shí)）。

6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK↓±£8量比較少(shǎo)，有(yǒu)可(kě)能(nénδ​≥✘g)因試劑沾在孔壁上(shàng)而帶來π®(lái)誤差，建議(yì)将槍頭浸入培養液中加入且在加完試劑後輕輕敲擊↑∏€培養闆以幫助混勻。

7、培養0.5-4小(xiǎo)時(shí):細胞種類不(bù)同，形成的(de)φ••'Formazan的(de)量也(yě)不(bù)一(yī'πσ)樣。如(rú)果顯色不(bù)夠的(de)話(huà)，可(kě)以繼續培養，以确認最佳條件↔π&>(jiàn)。特别是(shì)血液細胞形成的(de)Formazan很(£÷αhěn)少(shǎo)，需要(yào)較長(cháng)的(de)顯色時(shí)間★ (jiān)（5-6小(xiǎo)時(shí)）。

8、測定450nm吸光(guāng)度：建議(yì)采用(yòng ♠π")雙波長(cháng)進行(xíng)測定，檢測波長(cháng)450σπ -490nm，參比波長(cháng)600-650↓®nm。

五、實驗注意事(shì)項：

●若暫時(shí)不(bù)測定OD值，可(‌™kě)以向每孔中加入10 μL 0.1M的(de)HCL€©<溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養闆避光(guāng)保存在室溫條件(jiàn)下(x>♦σià)。24小(xiǎo)時(shí)內(nèi)測定，λφΩ✘吸光(guāng)度不(bù)會(huì)發生(shēng)變化(huà)。

●如(rú)果待測物(wù)質有(yǒu‌‌♦ )氧化(huà)性或還(hái)原性的(de)話(huà)，可(kě)在加CCK8之前更₹β£換新鮮培養基（除去(qù)培養基，并用(yòng)培養基洗滌細胞兩次，♠π然後加入新的(de)培養基），去(qù)掉藥物(wù)影(yǐng)響。當然藥物(wù)影(yǐ§​ng)響比較小(xiǎo)的(de)情況下(xià)，可(kě)以不(bù)更換培養基，直接λ©'¥扣除培養基中加入藥物(wù)後的(de)空(kōng)白(bái)吸收即可(kě)。

●當使用(yòng)标準96孔闆時(shí)，貼壁細胞的(de)最小(xiǎo)接種量至少(shǎ ₽π o)為(wèi)1,000 個(gè)/孔 (100 μ" &σl 培養基)。檢測白(bái)細胞時(shí)的(de)靈≤β敏度相(xiàng)對(duì)較低(dī)，因此推薦接種量不(bù)低(dī©≤)于2,500 個(gè)/孔 (100 μl 培養基)。

●酚紅(hóng)和(hé)血清對(duì)CCK8法的(de)檢測不(bù)會(huì)造♥→α成幹擾，可(kě)以通(tōng)過扣除空(kōng)白(bái)孔中本底& 的(de)吸光(guāng)度而消去(qù)。

●CCK8可(kě)以檢測大(dà)腸杆菌，但(dà¶ φ™n)不(bù)能(néng)檢測酵母細胞。在細胞增殖實驗每次測定的(de)過程中需要(yào)避™ ¶✘免細菌污染，以免影(yǐng)響結果。

●CCK-8在0-5℃下(xià)能(néng)夠保存至少(shǎo)6個(gè)月(yuè)，φ♠¥在-20℃下(xià)避光(guāng)可(kěΩ♥)以保存1年(nián)。

●當在培養箱內(nèi)培養時(shí)，培養闆最外(wài)一(yī)圈的(de)孔最容≈‍易幹燥揮發，由于體(tǐ)積不(bù)準确而增加誤差。一(yī)般情況下(xià)，最↓‍外(wài)一(yī)圈的(de)孔加培養基或者PBS，不(bù)作(zuò)為(wèi)×λ✘¶測定孔用(yòng)。

●在培養基中加入CCK8，培養一(yī)定的(de)時(shí)間(jiān)，↕€♥測定450 nm的(de)吸光(guāng)度即為(wèi♦✘>‍)空(kōng)白(bái)對(duì)照(zhào)。在做(zuò)加藥實驗時(shí)↔✔'，還(hái)應考慮藥物(wù)的(de)吸收，可(kě)在加入藥物(wù)的(de)培養基中®‌加入CCK8，培養一(yī)定的(de)時(sφ¶λhí)間(jiān)，測定450 nm的(de)吸光(guāng)度‌>™§作(zuò)為(wèi)空(kōng)白(bái)對(duì)照(φ↓≥÷zhào)。

●金(jīn)屬對(duì)CCK-8顯>™→色有(yǒu)影(yǐng)響：當終濃度為(wèi) &←1 mM的(de)氯化(huà)亞鉛、氯化(huà)鐵(tiě)、硫酸銅會(huì)抑制(zhì)≥∑εΩ5%、15%、90%的(de)顯色反應，使靈敏度降級。如(rú)果終濃度是(shì)10 mM的(δ≤∞de)話(huà)，将會(huì)100%抑制(zhì)。

●懸浮細胞由于染色比較困難，一(yī)般需要(yào)增加細胞♣δ★數(shù)量和(hé)延長(cháng)培養時(shí)間(jiān)。

●加入CCK-8 時(shí)，如(rú)果細胞培<¥←₹養時(shí)間(jiān)較長(cháng)，培養 ♥β基顔色或pH 值已變化(huà)，建議(yì)換用(yòng)新鮮的(de)≥÷€培養基。

●用(yòng)酶标儀檢測前需确保每個(gè)孔內(nè∏↕σi)沒有(yǒu)氣泡，否則會(huì)幹擾測定，且要(yào)擦拭幹淨樣品闆了(le)。λ♣

六、經驗總結及分(fēn)享：

CCK8的(de)說(shuō)明(míng)書(shū)大(dà)家≥•(jiā)一(yī)定要(yào)認真閱讀(dú)，裡(lǐ)面很(hěn)多(duō)細α"節的(de)問(wèn)題都(dōu)有(yǒu)↑¶§提到(dào)。而且說(shuō)明(míng)書(shū→&)裡(lǐ)提供的(de)一(yī)些(xiē)關于各種細胞的(de)種闆數(Ω&shù)都(dōu)很(hěn)有(yǒu•↕)參考價值，因為(wèi)那(nà)是(shì)™₹反複驗證過的(de)最佳數(shù)值。但(dàn)無論如(rú)何，做(zuò)這(zhè)個∞↓₩β(gè)試驗一(yī)定要(yào)摸條件(jiàn)。你(nǐ)πΩ‍♠就(jiù)算(suàn)再懶，這(zhè)個(gè)懶不(bù)得δα(de)，否則你(nǐ)都(dōu)隻是(sh ≤ ì)在做(zuò)無用(yòng)功。以下(xià)言論全部以細胞毒性試驗為(wèi)前↓©♥提， 如(rú)果你(nǐ)做(zuò)的(de)是(shì)促進£≈細胞生(shēng)長(cháng)的(de)藥物(wù)的(de)藥效實驗那(n∑↕à)就(jiù)另當别論了(le)。

摸條件(jiàn)包括1、種闆數(shù)；2、種闆後細胞的(de)貼壁生(shēng)長≤γ(cháng)時(shí)間(jiān)；3、加藥後的(de)孵育時(shí★ εφ)間(jiān)；4、cck8試劑加入量；5、cck8試劑加入後細胞孵育時(shí)間(jiāε‌≠n)。看(kàn)起來(lái)很(hěn)多(duō)，其實這(zhè'←•§)就(jiù)是(shì)一(yī)個(gè∞₽​£)實驗。而且都(dōu)是(shì)種的(de)空(kōng¶‍)白(bái)闆，也(yě)就(jiù)是(shì)不(bù)>✘→←加藥物(wù)，隻加細胞和(hé)CCK8。

1、種闆數(shù)：這(zhè)個(gè)要(yào)查文(wén)獻，看(‍→✘πkàn)你(nǐ)所用(yòng)細胞别人(rén↕λ✔)有(yǒu)無做(zuò)過，把範圍大(dà)緻找出。記住還(hái)要(yào)參考說(s♠♥huō)明(míng)書(shū)，這(zhè)個(gè)很(hěn)λ 重要(yào)。然後稀釋一(yī)系列濃度種闆。首先你(nǐ)要(yào)觀察多(duō)長(c¥¥háng)時(shí)間(jiān)細胞可(kě)貼壁完全，一(yī)般→∑≥β貼壁生(shēng)長(cháng)24小(xiǎo)時(shí)。然後還(hái)Ω♣♦有(yǒu)在你(nǐ)的(de)實驗時(shí)間(jiān)✘≤•'內(nèi)，不(bù)同細胞數(shù)下(xià)孔內(∏∑÷₹nèi)生(shēng)長(cháng)情況。比₽‌♠如(rú)我拟定考察4天的(de)時(shí)↑₹‌間(jiān)，那(nà)麽在4天內(nèi)，細胞是(shì)剛β‍ ↓好(hǎo)鋪滿還(hái)是(shì)堆積生(shēng)長(cháng)？因為(₹<♥&wèi)每塊闆都(dōu)會(huì)設置對(duì)照(zhào)孔→∏，也(yě)就(jiù)是(shì)含有(yǒu)細胞的(de)培養基+CC←£K8，這(zhè)個(gè)數(shù)值是(shì)闆上(shàng)的(de)最©≤× 大(dà)數(shù)值，CCK8試驗最佳ODπ‌±值在1.0附近(jìn)，所以這(zhè)個(gè)最大(™€•dà)數(shù)值最好(hǎo)能(néng)控制(zhì)在1.0左右。我的(deφβ ↑)實驗經驗是(shì)不(bù)要(yào)讓細胞₽¶φ長(cháng)滿，一(yī)旦長(cháng)滿了(£≈$>le)很(hěn)難去(qù)判斷是(s↕↑ hì)否堆積生(shēng)長(cháng)了(le)，對(duì)藥物(wù)能(né≤€ng)否順利進入細胞有(yǒu)影(yǐng)響←↑此為(wèi)其一(yī)，其二生(shēng)長(chángσ±λ)不(bù)均勻易導緻孔間(jiān)OD值數(shù)據偏差大(dà)，而且OD✔§值也(yě)很(hěn)大(dà)。

2、貼壁生(shēng)長(cháng)的(de)時(shí)間(jiān®‌₹)我一(yī)般就(jiù)直接讓它貼壁長(cháng)24h了(le)，這(zhè)個(g±π®‍è)時(shí)間(jiān)細胞已經貼壁完全，而且這(zhè)樣設置時(↓≥∏shí)間(jiān)對(duì)自(zì ✘≈®)己安排實驗時(shí)間(jiān)也(yě)方便。沒人(rén)願意大(dà)半夜爬起δ÷₽ 來(lái)做(zuò)實驗吧(ba)。

3、加藥後的(de)孵育時(shí)間(jiān)，我的(de)實驗摸了(le)3個(¶✔gè)時(shí)間(jiān)，24h，48h，72h。然後根♦®據數(shù)據的(de)穩定性（RSD）、OD值的(de)範圍（1.→∏β0左右）這(zhè)些(xiē)來(lái)選擇最好(h£πλǎo)的(de)時(shí)間(jiān)。太長( ↓÷↔cháng)了(le)就(jiù)沒有(yǒu)必要(÷λ€yào)了(le)，細胞呆在孔裡(lǐ)幾天不(bù)換液結果可(kě)≠≈Ω&想而知(zhī)了(le)。

4、CCK8試劑加入量，說(shuō)明(mí¶≥∞÷ng)書(shū)中明(míng)确寫出建議(yì)加入量為(wèi)培∏‌養基體(tǐ)積的(de)10%。這(zhè)裡(lǐ)有(yǒu)一(yī)個(gè£₩♣↔)問(wèn)題：假設我要(yào)孔內(nèi)是(£™∑shì)200微(wēi)升的(de)體(tǐ)系，即細胞懸液+藥液σ↑ +CCK8=200微(wēi)升呢(ne)，還(hái)是(shì)細胞懸液+藥液=2⧩Ω00微(wēi)升，cck8不(bù)算(suàn)在體 ©↑(tǐ)系內(nèi)呢(ne)。關于這(zhè)一(yī)點文(wén)獻報γ®‌(bào)道(dào)不(bù)一(yī)緻σ↓±☆。本人(rén)最終采用(yòng)的(de)是(shì)後者。

5、cck8試劑加入後孵育時(shí)間(jiān)，§≠随著(zhe)時(shí)間(jiān)的(de)增加，OD值就(jiù)會(huì)增大(→©€dà)。總之原則就(jiù)是(shì)把OD值控制(zhì)在1.0左右。這(zhè)裡(lα∞×ǐ)我考察了(le)0.5h、1.0h、2.0h。

再說(shuō)一(yī)下(xià)關于種闆設置問∞☆¶✔(wèn)題。衆所周知(zhī)周圍一(♥↑<yī)圈孔因為(wèi)邊緣效應都(dōu)是(shì)↓♦♥不(bù)用(yòng)來(lái)做(zuò)實驗的(de)。一(yī)般每組樣品我₽÷★♠會(huì)設置6個(gè)複孔，得(de)到(dào)的(d♠→♦e)OD值去(qù)掉最大(dà)值與最小(xiǎo)值，<>∑Ω其餘取平均值。我用(yòng)的(de)是(shì)排槍，會(huì)省很(h★®≈εěn)多(duō)力氣，但(dàn)是(shì)也(yě)會(huì)增大(dà)↑¶組內(nèi)誤差。這(zhè)個(gè)隻有(yǒu)通(tōng)過校(xiào)正移  ±¥液槍和(hé)選用(yòng)最适槍頭了(le)。

做(zuò)這(zhè)個(gè)實驗我想大(dà)家(jiā)遇到(dà§♦≥‍o)的(de)最大(dà)問(wèn)題應該是(shì)數(shù)據不♦≥(bù)穩定，組內(nèi)數(shù)據偏差大(dà)。講了(le)很(hěn)多(duō✔♣←÷)怎樣摸條件(jiàn)，其實就(jiù)一(yī)個(gè)原☆©✔​則，把OD值控制(zhì)在1.0左右。數( ​ε≥shù)據不(bù)穩定也(yě)隻能(néng)通(tōng)過增大(₩∞♣πdà)樣品數(shù)，借助數(shù)據處理(lǐ)來(lái)₽✔彌補。還(hái)有(yǒu)實驗操作(zuò£♣≈)一(yī)定要(yào)仔細小(xiǎo)心，盡量平≈ε  行(xíng)操作(zuò)。

補充： 突然想起用(yòng)酶标儀檢測的(de)時(shí)候還(hái)有(yǒu)≤​"一(yī)些(xiē)細節問(wèn)題。比如(rú)孔裡±δ‍≈(lǐ)不(bù)能(néng)有(yǒ‍™€u)氣泡，如(rú)果有(yǒu)氣泡，就(jiù)用(yòng)吸耳球吹掉，氣泡會≤₽(huì)很(hěn)影(yǐng)響檢測↑×γ結果。樣品闆要(yào)擦拭幹淨，當然了(le)，蓋子(zǐ)一(yī)定要(yào)記得(dφ✔γ≠e)拿(ná)掉啊Big Smile補充說(shuō)明(míng)：這§★(zhè)幾天有(yǒu)同學提出了(le)一(yī)個(gè)問(wèn)題，這(zhè)個αγ(gè)問(wèn)題非常好(hǎo)也(yě)♦®σ非常關鍵：将OD值控制(zhì)在1.0這(zhè)個(gè)說(shuō)法是(shì)否有(y¥ ®ǒu)依據？

這(zhè)裡(lǐ)我還(hái)是(shì)想提醒大(dà)家(jiā)一(yī↕σ£​)定要(yào)認真閱讀(dú)試劑盒的(de)說(shuō)明(míng)書(shū)，≤§試想一(yī)個(gè)試劑盒的(de)上(shàng)市(shì)并且∑&π♠作(zuò)為(wèi)技(jì)術(shù)手段得(de)到(dào)認可(k₹ ‌ě)需要(yào)經過多(duō)少(sh₹&ǎo)試驗反複驗證。我購(gòu)買的(dσ÷₹e)是(shì)同仁化(huà)學研究所的(de)CCK8試劑盒，說(sγ₹♦huō)明(míng)書(shū)的(de)P7Q23：OD值在什(shén)麽範圍比≠λ↑'較合适？答(dá)：一(yī)般情況下(xià)OD值在0.1-2.0都(dōu)可(kě)以，∏←在1.0附近(jìn)比較好(hǎo)。

再說(shuō)到(dào)自(zì)己的(de)實驗設計(jì<>)，酶标儀的(de)原理(lǐ)其實和(hé)紫外(wài)分(fēn)光(gφ✘ ↔uāng)光(guāng)度計(jì)是(shì)一(yī)樣π$的(de)，所以UV上(shàng)很(hěn)多(duō)減小(xiǎo)誤差的(de←§)注意事(shì)項在酶标儀上(shàng)同樣受用(yòng)。這(zh  &<è)就(jiù)能(néng)夠理(lǐ)↔γ解為(wèi)什(shén)麽不(bù)能(né✘γεng)有(yǒu)氣泡，為(wèi)什(shén)麽要(yào)擦拭幹€λ±淨樣品闆了(le)。再者熟悉UV原理(lǐ)的(de)同學會(huì)了(le)解αφ•利用(yòng)紫外(wài)檢測有(yǒu)一(yī)個∑↔≠(gè)最佳檢測範圍，超過了(le)這(zhè)個(gè)範圍，數(shù)值就(jiù€<)會(huì)呈現(xiàn)出不(bù)穩定，無規律。（大(dà)家(jiā)可(kě)以把自(‍ ©zì)己的(de)數(shù)據統計(jì)分(fēn)析看(kàn)看(kàn)是(shì)不(× ©δbù)是(shì)數(shù)值控制(zhì)在1.0附近(jìn)更穩定。）而更有(yǒ↑≥‌↔u)甚者就(jiù)是(shì)超出了(le)儀器(qì)的(de)檢•±測範圍，儀器(qì)讀(dú)數(shù)為(wèi)—。我在摸條件(jiàn)的(de)時(s¥&hí)候，cck8加入2.0h後檢測就(jiù)出現(xiàn)過酶标儀讀(dú≠≥ )不(bù)出數(shù)據的(de)情況。