1. 實驗材料：

(1) TBS和(hé)PBS。

(2) 固定液：4%甲醛或100%冰預冷(lěng)甲醇。

(3) 破膜劑：（PBS配至，W/V）

(4) 封閉液：含10%FBS的(de) TBS，FBS種屬與二抗來(lπ <'ái)源種屬一(yī)緻；0.1%Triton X-100

(5) 一(yī)抗：純化(huà)級或生(shēng)物(‍<δwù)素級别。

(6) 二抗：抗生(shēng)物(wù)素♥$↑的(de)（三步法）或直标的(de)（二步法）φ♠。

(7) 顯色劑：抗生(shēng)物(wù)素的(de)eFluor 605NC（CAT#93-2✘≠317）或抗生(shēng)物(wù)素的(de)eFluor 650NC（Cδε¶AT#95-2317）或抗生(shēng)物(wù)素的(de)FITC（CAT#11-4' ♦317）

(8) 包埋劑：Fluoromount-G（southernBiotech）or Fluoro∏φ≠-Gel（EMS）。

(9) 濕盒。

2. 實驗步驟：

(1) 制(zhì)備細胞塗片或爬片，細胞密度要(yào)适當。

(2) 用(yòng)4%甲醛室溫固定細​•¥胞15min或用(yòng)100%甲醇-20度固定10min。

(3) PBS洗滌3次，每次5min。吸管滴加和(hé)吸取↑♠φ®。注意：避免細胞幹燥，以免增加非特異背景。

(4) 破膜劑破膜，蓋封口膜防止蒸發，濕盒室溫孵育10min後，37度孵育30min。

(5) PBS洗滌3次，每次5min。吸管滴加和(hé)吸取。

(6) 封閉液封閉細胞，每一(yī)小(xiǎo)格100ul，（8格玻片）室溫濕盒孵育Ω☆™1小(xiǎo)時(shí)。

(7) 小(xiǎo)心移去(qù)封口膜，PBS洗滌3次，☆γ≠↕每次5min。吸管滴加和(hé)吸取。

(8) 用(yòng)封閉液按照(zhào)說(shuō)明(mí‍ ®ng)書(shū)稀釋一(yī)抗，加一(yī)抗濕盒中室溫孵育2小§∑(xiǎo)時(shí)。低(dī)豐度的(de)抗原一(yī)≈≤×般4度孵育12小(xiǎo)時(shí)以上(shàng​λ)。

(9) TBS，慢(màn)速振蕩洗滌3次，每次5min。如(rú)果是(s↔γφ★hì)未結合的(de)一(yī)抗繼續步驟10（一(yī)步法）；如(rú)果&‌是(shì)生(shēng)物(wù)素化(huà)的§↓♥(de)一(yī)抗則跳(tiào)到(dào)步∑✔<驟12。

(10) 按照(zhào)說(shuō)明(míng)書(shū)稀釋抗生(sh ©€₽ēng)物(wù)素或熒光(guāng)标記的(de)二抗，蓋膜，室溫濕盒孵'σ↔育1小(xiǎo)時(shí)。注意：如(rú)果二抗是(shì)結合熒光(guāng)素的(de®λ)，則需要(yào)避光(guāng)并且去(qù)掉封閉液中的(de)Triton €÷≠X-100。

(11) TBS洗三次，方法同上(shàng)。

(12) 按建議(yì)濃度（1:100）稀釋顯影(yǐn₹φ≥​g)劑：抗生(shēng)物(wù)素的(de)eFluor 605NC（CAT#93-2₩δ♠317）或抗生(shēng)物(wù)素的(de)eFluor 650NC（CAT#95-231±↑7）或抗生(shēng)物(wù)素的(de)FITC（CAT#11>±♠-4317）。室溫避光(guāng)孵育30min。

(13) TBS洗3次，方法同上(shàng)。

(14) 封片，4度避光(guāng)保存或直接熒光(guāng)顯微(wēi)∑✔₩↓鏡觀察拍(pāi)照(zhào)。