無信号

一(yī)抗和(hé)二抗不(bù)匹配

二抗需和(hé)一(yī)抗宿主的(de)物(wù)種相(xiàng)同（如(rú>→∞σ)一(yī)抗來(lái)自(zì)兔，二抗為(wèi)抗兔抗體(tǐ)）。

沒有(yǒu)足夠的(de)一(yī)抗或二抗結合目标蛋白(bái)

使用(yòng)高(gāo)濃度抗體(tǐ)，延<★→£長(cháng)4℃孵育時(shí)間(jiān)（如(rú)過​↑夜）。

封閉劑與一(yī)抗或二抗有(yǒu)交叉反應

使用(yòng)溫和(hé)的(de)去(qù)污劑如(rú)吐溫-2↕∑≥0，或更換封閉劑（常用(yòng)的(de)脫脂奶粉、BSA、血↕♣♦₽清或明(míng)膠）。

一(yī)抗不(bù)識别檢測物(wù)種的(de)蛋白(bγ↓Ω®ái)

參照(zhào)說(shuō)明(míng)書(shū)，比對(duì)免疫原序列和(h↔★δé)蛋白(bái)序列以确保抗體(tǐ)和≈₩(hé)目的(de)蛋白(bái)會(huì)發生(£ ↔∏shēng)反應，設置陽性對(duì)照(zhào)。

抗原量不(bù)足

每泳道(dào)蛋白(bái)上(shàng©§>)樣量不(bù)低(dī)于20-30μg，使§± ∑用(yòng)蛋白(bái)酶抑制(zhì)劑并設置陽性對(duì)照(zhào)。

組織中目的(de)蛋白(bái)含量低(dī)

濃縮使信号最大(dà)化(huà)（例如(rú)檢測核蛋白(bái)要(yào)用(¶$ yòng)核裂解物(wù)）。

轉膜不(bù)充分(fēn)

使用(yòng)可(kě)逆染色劑例如(rú)麗(lì)春紅(hóng)S檢≤‌★₹測轉膜效果，檢查轉膜操作(zuò)是(shì)否正确。PVDF膜需預↑ ®δ先浸在甲醇中，然後浸到(dào)轉移緩沖液中。

洗膜過度

勿過度洗膜。

過度封閉使目标蛋白(bái)不(bù)能(néng)顯色

代替5%脫脂奶粉，使用(yòng)含0.λ₽5%脫脂奶粉或無脫脂奶粉的(de)抗體(tǐ)稀釋液，或更換封閉劑，減少(shǎo)$π↔∏封閉時(shí)間(jiān)。

一(yī)抗失效

使用(yòng)新鮮一(yī)抗，重複使用(yòng)有(yǒu)效濃度會★×(huì)降低(dī)。

二抗受疊氮鈉抑制(zhì)

避免疊氮鈉和(hé)HRP标記抗體(tǐ)一(yī)起使用(yòng)。

檢測試劑盒過期和(hé)底物(wù)失活

使用(yòng)新鮮的(de)底物(wù)。

背景高(gāo)

未進行(xíng)非特異性封閉或封閉不(bù)充 '•&分(fēn)

延長(cháng)封閉時(shí)間(jiān‌©φ)，考慮更換合适的(de)封閉劑。推薦使用(yòng)5%脫脂奶粉、3%BS↑€←<A或血清封閉30分(fēn)鐘(zhōng)。這(zhè)些(x‍↔✘iē)可(kě)以包含在抗體(tǐ)緩沖液中。

一(yī)抗濃度過高(gāo)

稀釋抗體(tǐ)至合适濃度，以更高(gāo)稀釋度抗體(tǐ)孵育 ♣™更長(cháng)時(shí)間(jiān)。

抗體(tǐ)孵育溫度過高(gāo)

4℃孵育。

二抗與封閉劑非特異性結合或反應

設置二抗對(duì)照(zhào)（不(bù)加一(yī)抗）。

一(yī)抗或二抗與封閉劑有(yǒu)交叉反應

在孵育和(hé)洗滌液中加入溫和(hé)去(qù)污劑如(rú​∑'λ)吐溫-20。脫脂奶粉含有(yǒu)酪蛋<δ≈白(bái)，該蛋白(bái)本身(shēn)就(ji★"ù)是(shì)一(yī)種磷酸化(huà)蛋白(bái)，會(huì)結合©♥≠磷酸化(huà)特異性抗體(tǐ)而易産生(shēng)高(gāo)背景。使用(yòng)BS™β∑A代替奶粉作(zuò)為(wèi)封閉劑。

未結合蛋白(bái)質洗滌不(bù)充分(fēn)≥​

增加洗滌次數(shù)。

膜的(de)選擇導緻的(de)高(gāo)背景

NC膜比PVDF膜背景低(dī)。

膜幹燥

在孵育過程中防止膜變幹，在任何步驟都(dōu)保證膜有(yǒu)充分(fēn)的(de)反應液，δφ€≠放(fàng)入攪拌子(zǐ)不(bù)斷攪動或輕輕震蕩使膜浸在溶液中。

多(duō)帶現(xiàn)象

細胞傳代次數(shù)過多(duō)，使其蛋白(bái)表®¶達不(bù)同

使用(yòng)原始未傳代的(de)細胞株，和(hé)現(xiàn)在的(de)細胞株∞♦•一(yī)起做(zuò)平行(xíng)對(duì)照(zhào)實驗。

體(tǐ)內(nèi)表達的(de)蛋白(bái)樣本具有(yǒu)多(duō)種ε 修飾形式如(rú)乙酰化(huà)、甲基化(huà)、烷基化(huà)、磷酸化(huà)、糖基化₹♣(huà)等

查閱文(wén)獻，使用(yòng)試劑使樣品去(qù)磷酸化(huà)、去(qù)糖基化δ≠φ→(huà)來(lái)驗證翻譯後的(deε₹π®)修飾。

蛋白(bái)樣本降解（蛋白(bái)質分(fēn)子(zǐ)₹±✘σ量降低(dī)）

在樣品緩沖液中加入足夠的(de)蛋白(bái)酶抑制(zhφ¶ì)劑。

檢測到(dào)未經報(bào)道(dào)過的(de)新蛋白(bái)或同一(yī)蛋白(báπ&i)家(jiā)族中具有(yǒu)相(xiàng)似表位而結構不(bù)同的(de)蛋白(bái)α©

查閱其他(tā)文(wén)獻報(bào)道(dào)，或BLAST搜尋，使用(yòng)說(↑±shuō)明(míng)書(shū)推薦的(de)細胞株或組織。

一(yī)抗濃度過高(gāo)，高(gāo)濃度時(shí)ε↓常出現(xiàn)多(duō)條蛋白(bái)帶

降低(dī)抗體(tǐ)濃度和(hé)/或孵育時(shí)間(jiān)。

二抗濃度過高(gāo)，高(gāo)濃度産生(shēng)非特≠↓σ異性結合

降低(dī)抗體(tǐ)濃度，增加二抗對(duì)照(zhào)（不(∞πbù)加一(yī)抗）。

抗體(tǐ)未經純化(huà)

使用(yòng)親和(hé)純化(huà)的(de)抗體(tǐ)，減少(shǎo)非特異性→✘£條帶。

條帶為(wèi)非特異性條帶

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應用(yòng)封閉多(duō)肽來(lái)區(qū)分(fēn)特異性和(hé)非©<$特異性條帶，隻有(yǒu)特異性條帶能(nén♠πg)被封閉從(cóng)而消失

靶蛋白(bái)形成多(duō)聚體(tǐ)

SDS-PAGE電(diàn)泳上(shàng)樣前，煮沸10₽ λ£分(fēn)鐘(zhōng)而不(bù)是(shì)5分(fēn)♥•÷鐘(zhōng)，使蛋白(bái)解聚

背景有(yǒu)不(bù)均勻的(de)白(bá'→i)色斑點

轉膜時(shí)膜上(shàng)有(yǒu)氣泡或抗體(tǐ)在膜上(shàng)分(f±♣ēn)布不(bù)均

轉膜過程中盡量去(qù)除氣泡，抗體(tǐ)孵育時(shí)保持搖動。

背景有(yǒu)黑(hēi)色斑點

抗體(tǐ)結合了(le)封閉劑

過濾封閉劑。

深背景出現(xiàn)白(bái)色條帶（非預期背景）

一(yī)抗或二抗加入過多(duō)

稀釋抗體(tǐ)的(de)濃度。

分(fēn)子(zǐ)量蛋白(bái)标準條帶呈黑(hēi)色

抗體(tǐ)和(hé)分(fēn)子(zǐ)量蛋白(bái)标準發生(shēng)了(le)β"±¶反應

在分(fēn)子(zǐ)量蛋白(bái)标準和(hé)第一(yī)個(gè) ±δ 樣品之間(jiān)增加一(yī)個(gè)空(kōng)白(bái)條帶。

目的(de)條帶染色過低(dī)/過高(gāo)

分(fēn)離(lí)不(bù)徹底

改變凝膠比例：分(fēn)子(zǐ)量大(dà)的(de)蛋白(bái)用(yòng)低(dī) ≈≤©濃度膠，分(fēn)子(zǐ)量小(xiǎo)的(de)蛋白(bái)用(yòng)高≥π(gāo)濃度膠。

“微(wēi)笑(xiào)”條帶

遷移過快(kuài)；電(diàn)泳溫度過高(gāo)（改變了(le)PH值和(hé)遷移速度）✘‌©

降低(dī)遷移速度或低(dī)溫電(diàn)泳（冰庫或冰上(sε&hàng)）。

相(xiàng)同的(de)蛋白(bái)雜(zá)交出現(xiàn)大(dà)小(xiǎ₹ <εo)不(bù)均勻條帶

制(zhì)備凝膠時(shí)凝膠凝固太快(kuài♥β↑)，緻使泳道(dào)中丙烯酰胺的(de)比例不(bù)均☆<&λ勻

參照(zhào)凝膠的(de)配方，在凝膠中加入适量TEMED，放(fàng→ σ)置時(shí)在凝膠頂部加入适量0.1%SDS（水(shuǐ)稀釋）以防凝¥§膠變幹。

凝膠染色不(bù)均勻

細菌污染；抗體(tǐ)量不(bù)足

4℃保存抗體(tǐ)并使用(yòng)新鮮的(de)緩沖液浸泡凝膠；确Ω★€保在振蕩孵育時(shí)抗體(tǐ)充分(fē"<n)浸沒膜。